Schlangevenom enthält Enzyme déi Carboxylesterbindungen hydrolyséieren.D'Substrate fir d'Hydrolyse si Phospholipiden, Acetylcholin an aromatesch Acetat.Dës Enzyme enthalen dräi Aarte: Phospholipase, Acetylcholinesterase an aromatesch Esterase.Arginineesterase am Schlangegif kann och synthetesch Arginin oder Lysin hydrolyséieren, awer et hydrolyséiert haaptsächlech Proteinpeptidbindungen an der Natur, sou datt et zu Protease gehéiert.D'Enzyme, déi hei diskutéiert ginn, handelen nëmmen op Estersubstrater a kënnen net op all Peptidbindung handelen.Ënner dësen Enzymen sinn d'biologesch Funktiounen vun Acetylcholinesterase a Phospholipase méi wichteg a si komplett studéiert.E puer Schlangevenom hunn eng staark aromatesch Esteraseaktivitéit, déi p-Nitrophenylethylester, en - oder P-Naftalenacetat an Indolethylester hydrolyséiere kann.Et ass nach ëmmer onbekannt ob dës Aktivitéit duerch en onofhängegen Enzym produzéiert gëtt oder eng bekannte Nebenwirkung vu Carboxylesterase, eleng seng biologesch Bedeitung.Wann de Gëft vum Agkistrodon halys Japonicus mat p-Nitrophenylethylester an Indoleethylester reagéiert gouf, goufen d'Hydrolysaten vum p-Nitrophenol an Indolephenol net fonnt;Am Géigendeel, wann dës Ester mat Kobra Zhoushan Ënnerarten Schlangevenom a Bungarus multicinctus Schlangegif reagéieren, gi se séier hydrolyséiert.Et ass bekannt datt dës Kobra-Gëfter eng staark Cholinesterase-Aktivitéit hunn, wat verantwortlech ass fir d'Hydrolyse vun den uewe genannte Substrate.Tatsächlech, Mclean et al.(1971) bericht datt vill Schlaangengëfter, déi zu der Cobra Famill gehéieren, Indolethylester, Naphthalenethylester a Butylnaphthalenester hydrolyséiere kënnen.Dës Schlangegëfter kommen aus: Kobra, Schwaarzhals Kobra, Schwaarze Lëpsen Kobra, Gëllene Kobra, Ägyptesch Kobra, Kinnekskobra, Gëllene Kobra Mamba, Schwaarze Mamba a wäiss Lëpsen Mamba (D.
De Schlangegif kann Methylindoleethylester hydrolyséieren, wat de Substrat ass fir d'Cholinesterase Aktivitéit am Serum ze bestëmmen, awer dëst Schlaanggif weist keng Cholinesterase Aktivitéit.Dëst weist datt et eng onbekannt Esterase am Cobra Gëft ass, wat anescht ass wéi Cholinesterase.Fir d'Natur vun dësem Enzym ze verstoen, ass weider Trennungsaarbecht gebraucht.
1, Phospholipase A2
(I) Iwwersiicht
Phospholipase ass en Enzym dat Glycerylphosphat hydrolyséiere kann.Et gi 5 Aarte vu Phospholipase an der Natur, nämlech Phospholipase A2 a Phospholipase
A., phospholipase B, phospholipase C an phospholipase D. D'Schlaang Gëft enthält haaptsächlech phospholipase A2 (PLA2), e puer Schlaang Gëft enthalen phospholipase B, an aner phospholipases sinn haaptsächlech an Déier Stoffer a Bakterien fonnt.Fig. 3-11-4 weist d'Aktiounsplaz vun dëse Phospholipasen op der Substrathydrolyse.
Ënnert Phospholipasen ass PLA2 méi studéiert ginn.Et kann dat am meeschte studéierten Enzym am Schlangegif sinn.Säin Substrat ass d'Esterbindung op der zweeter Positioun vum Sn-3-Glyerophosphat.Dëst Enzym ass wäit a Schlaangenvenom, Bienenvenom, Skorpionvenom an Déieregewebe fonnt, a PLA2 ass reichend a véier Famill Schlangevenomen.Well dëst Enzym rout Bluttzellen brécht a Hämolyse verursaacht, gëtt et och "Hämolysin" genannt.E puer Leit nennen och PLA2 hemolytesch Lecithinase.
De Ludeeke huet fir d'éischt festgestallt datt Schlangevenom eng hemolytesch Verbindung produzéiere kann andeems se op Lecithin duerch Enzymen handelen.Later, Delezenne et al.bewisen datt wann Cobra Gëft op Päerdsserum oder Eegiel handelt, et eng hemolytesch Substanz bilden.Et ass elo bekannt datt PLA2 direkt op d'Phospholipiden vun der Erythrozyt-Membran handelen kann, d'Struktur vun der Erythrozyte-Membran zerstéieren an direkt Hämolyse verursaachen;Et kann och op Serum oder dobäi Lecithin handelen fir hemolytesch Lecithin ze produzéieren, wat op roude Bluttzellen wierkt fir indirekt Hämolyse ze produzéieren.Och wann PLA2 reichend ass an de véier Famille vu Schlaangenvenomen, ass den Inhalt vun Enzymen a verschiddene Schlangevenom liicht anescht.Rattlesnake (C
Schlangevenom huet nëmme schwaach PLA2 Aktivitéit gewisen.Table 3-11-11 illustréiert de Verglach vun der PLA2 Aktivitéit vun 10 Haaptgëfte vu gëftege Schlangen a China.
Table 3-11-11 Verglach vu Phospholipase VIII Aktivitéite vun 10 Schlangevenomen a China
Schlangegif
Fett Verëffentlechung
Aliphatesch Säure,
Cjumol/mg)
Hämolytesch Aktivitéit CHU50/^ g * ml)
Schlangegif
Fräisetzung Fettsäuren
(^raol/mg)
Hämolytesch Aktivitéit "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9, 62
eelef
Micracephal ophis
fënnef Punkt een null
kalyspallas
8, 68
zweedausend aachthonnert
gracilis
V, Akut
7, 56
*** #
Ophiophagus hannah
dräi Punkt aacht zwee
honnert a véierzeg
Bnugarus fasctatus
7,56
zweehonnert aachtzeg
B. multicinctus
ee Punkt néng sechs
zweehonnert aachtzeg
Viper a Russelli
siwen Punkt null dräi
T, mucrosquamatus
ee Punkt aacht fënnef
Siamensis
T. stejnegeri
0, 97
（2） Trennung a Reinigung
Den Inhalt vu PLA2 am Schlangegif ass grouss, an et ass stabil fir Hëtzt, Säure, Alkali an Denaturant, sou datt et einfach ass PLA2 ze purifizéieren an ze trennen.D'gemeinsame Method ass fir d'éischt Gelfiltratioun op de roude Venom auszeféieren, dann Ionenaustauschchromatographie auszeféieren, an de nächste Schrëtt kann widderholl ginn.Et sollt bemierkt datt d'Gefriertrocknung vu PLA2 no Ionenaustauschchromatographie keng Aggregatioun verursaache sollt, well de Gefriertrocknungsprozess dacks d'ionesch Stäerkt am System erhéicht, wat e wichtege Faktor ass, deen d'Aggregatioun vu PLA2 verursaacht.Zousätzlech zu den uewe genannten allgemenge Methoden sinn déi folgend Methoden och ugeholl ginn: ① Wells et al.② De Substratanalog vu PLA2 gouf als Ligand fir Affinitéitschromatographie benotzt.Dëse Ligand ka sech un PLA2 a Schlangegif mat Ca2+ binden.EDTA gëtt meeschtens als Eluent benotzt.Nodeems Ca2 + ewechgeholl gëtt, fällt d'Affinitéit tëscht PLA2 a Ligand erof, an et kann aus Ligand dissoziéiert ginn.Anerer benotzen 30% organesch Léisung oder 6mol/L Harnstoff als Eluent.③ Hydrophob Chromatographie gouf mat PheiiylSephar0SeCL-4B gemaach fir Spuer PLA2 am Kardiotoxin ze läschen.④ Anti PLA2 Antikörper gouf als Ligand benotzt fir Affinitéitschromatographie op PLA2 auszeféieren.
Bis elo sinn eng grouss Zuel vu Schlaangenvenom PLAZ gereinegt ginn.Tu et al.(1977) opgezielt PLA2 gereinegt aus Schlaangenom virun 1975. An de leschte Jore sinn all Joer eng grouss Zuel vun Artikelen iwwer Trennung a Reinigung vu PLA2 gemellt ginn.Hei konzentréiere mir eis op d'Trennung an d'Preinung vu PLA vu chinesesche Geléiert.
Chen Yuancong et al.(1981) getrennt dräi PLA2 Arten vum Gëft vum Agkistrodon halys Pallas zu Zhejiang, déi an sauer, neutral an alkalesch PLA2 opgedeelt kënne ginn no hiren isoelektresche Punkten.No senger Toxizitéit ass neutral PLA2 méi gëfteg, wat als presynaptescht Neurotoxin Agkistrodotoxin identifizéiert gouf.Alkalesch PLA2 ass manner gëfteg, a sauer PLA2 huet bal keng Toxizitéit.Wu Xiangfu et al.(1984) verglach d'Charakteristiken vun dräi PLA2s, dorënner Molekulare Gewiicht, Aminosaier Zesummesetzung, N-terminal, isoelektresche Punkt, thermesch Stabilitéit, Enzym Aktivitéit, Toxizitéit an hemolytic Aktivitéit.D'Resultater weisen datt se ähnlech Molekulargewiicht an thermesch Stabilitéit haten, awer wesentlech Differenzen an aneren Aspekter haten.Am Aspekt vun der Enzymaktivitéit war sauer Enzymaktivitéit méi héich wéi alkalesch Enzymaktivitéit;Den hemolyteschen Effekt vum alkalesche Enzym op de roude Blutzellen war de stäerkste, gefollegt vun engem neutralen Enzym, a sauer Enzym kaum hemolyséiert.Dofir gëtt spekuléiert datt den hemolyteschen Effekt vu PLAZ mat der Ladung vum PLA2 Molekül verbonnen ass.Zhang Jingkang et al.(1981) hunn Agkistrodotoxin Kristalle gemaach.Tu Guangliang et al.(1983) gemellt datt eng gëfteg PLA mat engem isoelektresche Punkt vu 7. 6 aus dem Gëft vum Vipera rotundus vu Fujian isoléiert a gereinegt gouf, a seng physesch a chemesch Eegeschaften, Aminosaier Zesummesetzung an d'Sequenz vun 22 Aminosaierreschter am N -Terminal bestëmmt goufen.Li Yuesheng et al.(1985) isoléiert a gereinegt en anere PLA2 aus dem Gëft vum Viper rotundus zu Fujian.D'Ënnerunitéit vum PLA2 * ass 13 800, den isoelektresche Punkt ass 10,4, an déi spezifesch Aktivitéit ass 35/xnioI/miri mg。 Mat Lecithin als Substrat ass den optimale pH vum Enzym 8,0 an déi optimal Temperatur ass 65 ° C LD5 intravenös a Mais injizéiert.Et ass 0,5 ± 0,12mg/kg.Dëst Enzym huet evident antikoagulant an hemolytesch Effekter.Déi gëfteg PLA2 Molekül besteet aus 123 Reschter vun 18 Aarte vun Aminosäuren.D'Molekül ass räich u Cystein (14), Asparaginsäure (14) a Glycin (12), awer enthält nëmmen ee Methionin, a säin N-Terminal ass Serinreschter.Am Verglach mat PLA2 isoléiert vum Tuguang, ass d'Molekulargewiicht an d'Zuel vun Aminosaierreschter vun deenen zwee Isoenzyme ganz ähnlech, an d'Aminosäure Zesummesetzung ass och ganz ähnlech, awer d'Zuel vun Asparaginsäure a Prolinreschter ass e bëssen anescht.Guangxi King Cobra Schlangegif enthält räich PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) isoléiert e PLA2 aus dem Gëft, deen eng spezifesch Aktivitéit 3,6 Mol méi héich wéi dat ursprénglecht Gëft huet, e Molekulargewiicht vun 13000, eng Zesummesetzung vun 122 Aminosaierreschter, en isoelektresche Punkt vun 8,9 a gutt thermesch Stabilitéit.Vun der Elektronenmikroskop Observatioun vum Effekt vun Basis PLA2 op rout Bluttzellen, kann et gesi ginn datt et evident Effekt op mënschlech rout Bluttzellmembran huet, awer keen offensichtlechen Effekt op Geess rout Bluttzellen huet.Dëse PLA2 huet offensichtlech Verzögerungseffekt op d'elektrophoretesch Geschwindegkeet vu roude Bluttzellen bei Mënschen, Geessen, Huesen a Meerschwäin.Chen et al.Dëst Enzym kann d'Blockéierungsaggregatioun hemmen, déi duerch ADP, Kollagen a Natriumarachidonsäure induzéiert gëtt.Wann d'PLA2 Konzentratioun 10/xg/ml~lOOjug/ml ass, gëtt d'Platzaggregatioun komplett hemmt.Wann gewäsch Plättchen als Material benotzt goufen, konnt PLA2 d'Aggregatioun net bei der Konzentratioun vun 20Mg /ml hemmen.Aspirin ass en Inhibitor vun der Cyclooxygenase, wat den Effekt vu PLA2 op Thrombozyten hemméiere kann.PLA2 kann d'Blockéierungsaggregatioun hemmen andeems d'Arachidonsäure hydrolyséiert fir Thromboxan A2 ze synthetiséieren.D'Léisungskonformatioun vu PLA2 produzéiert vum Agkistrodon halys Pallas Venom an der Zhejiang Provënz gouf duerch kreesfërmeg Dikroismus, Fluoreszenz an UV Absorptioun studéiert.D'experimentell Resultater weisen datt d'Haaptkettekonformatioun vun dësem Enzym ähnlech war wéi déi vun der selwechter Aart Enzym vun aneren Arten a Gattungen, d'Skelettkonformatioun hat gutt Hëtztbeständegkeet, an d'strukturell Ännerung vun der sauer Ëmfeld war reversibel.D'Kombinatioun vum Aktivator Ca2+ an Enzym beaflosst net d'Ëmfeld vun Tryptophanreschter, während den Inhibitor Zn2+ de Géigendeel mécht.De Wee wéi de pH-Wäert vun der Léisung d'Enzymaktivitéit beaflosst ass anescht wéi déi uewe genannte Reagenzen.
Am Prozess vun der PLA2 Reinigung vum Schlangegif ass en offensichtleche Phänomen datt e Schlangegif zwee oder méi PLA2 Elutiounspeaks enthält.Dëst Phänomen kann esou erkläert ginn: ① wéinst der Existenz vun Isozymen;② Eng Aart vu PLA2 ass polymeriséiert an eng Vielfalt vu PLA2 Mëschunge mat verschiddene Molekulargewiicht, déi meescht vun deenen am Beräich vun 9 000 ~ 40 000 sinn;③ D'Kombinatioun vu PLA2 an aner Schlangevenom Komponenten komplizéiert PLA2;④ Well d'Amidebindung am PLA2 hydrolyséiert ass, ännert sech d'Laascht.① An ② sinn heefeg, mat nëmmen e puer Ausnahmen, wéi PLA2 am CrWa/w Schlangegif
Et ginn zwou Situatiounen: ① an ②.Déi drëtt Conditioun gouf am PLA2 am Gëft vun de folgende Schlaangen fonnt: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Palestinian Viper, Sand Viper, a schrecklech Klapperschlang km.
D'Resultat vum Fall ④ mécht d'Migratiounsgeschwindegkeet vu PLA2 während der Elektrophorese änneren, awer d'Aminosäure Zesummesetzung ännert sech net.Peptiden kënnen duerch Hydrolyse gebrach ginn, awer allgemeng sinn se nach ëmmer duerch Disulfidbindungen zesummen gebonnen.D'Gëft vun der ëstlecher Pit Klappschlaang enthält zwou Forme vu PLA2, genannt Typ a respektiv Typ p PLA2.Den Ënnerscheed tëscht dësen zwou Aarte vu PLA2 ass nëmmen eng Aminosaier, dat heescht, Glutamin an enger PLA2 Molekül gëtt duerch Glutaminsäure an der anerer PLA2 Molekül ersat.Och wann de genaue Grond fir dësen Ënnerscheed net kloer ass, gëtt et allgemeng ugeholl datt et mat der Deaminéierung vu PLA2 verbonnen ass.Wann PLA2 am palästinensesche Viper Gëft waarm gehale gëtt mam rauwe Gëft, ginn d'Enngruppen a sengen Enzymmoleküle méi wéi virdrun.Vun C PLA2 isoléiert aus Schlaang Gëft huet zwee verschidden N-Terminal, a seng molekulare Gewiicht ass 30000. Dëst Phänomen kann duerch d'asymmetric dimer vun PLA2 verursaacht ginn, déi ähnlech dem symmetresche dimer vun PLA2 am Gëft vun ëstlech Diamondback Klapperschlaang geformt ass a westlech Diamondback rattlesnake.Déi asiatesch Kobra besteet aus villen Ënnerarten, vun deenen e puer net ganz definitiv an der Klassifikatioun sinn.Zum Beispill, wat fréier d'Cobra Outer Caspian Ënnerart genannt gouf, gëtt elo unerkannt
Et soll dem baussenzege Kaspesche Mier Cobra zougeschriwwen ginn.Well et vill Ënnerarten sinn a si matenee gemëscht ginn, variéiert d'Zesummesetzung vum Schlangegif immens wéinst verschiddene Quellen, an den Inhalt vu PLA2 Isozymen ass och héich.Zum Beispill, Cobra Gëft
Op d'mannst 9 Aarte vu PLA2 Isozyme vun r ^ ll Arten goufen fonnt, a 7 Aarte vu PLA2 Isozyme goufen am Gëft vun der Cobra Ënnerart Caspian fonnt.Durkin et al.(1981) studéiert de PLA2 Inhalt an d'Zuel vun Isozymen a verschiddene Schlaangengëfter, dorënner 18 Kobra Gëfter, 3 Mamba Gëfter, 5 Viper Gëfter, 16 Klapperschlaang Gëfter an 3 Mier Schlaang Gëft.Am Allgemengen ass d'PLA2 Aktivitéit vu Cobra Venom héich, mat villen Isozymen.D'PLA2 Aktivitéit an d'Isozyme vum Vipervenom si mëttel.D'PLA2 Aktivitéit vu Mamba Gëft a Klapperschlaangen ass ganz niddereg oder keng PLA2 Aktivitéit.D'PLA2 Aktivitéit vum Mier Schlangegif ass och niddereg.
An de leschte Joeren ass et net gemellt ginn datt PLA2 am Schlangegif a Form vun aktiven Dimer existéiert, sou wéi den ëstlechen Rhombophora Klapperschlaang (C. Schlangevenom enthält Typ a an Typ P PLA2, déi allebéid aus zwee identesche Ënnerunitéiten zesummegesat sinn , an nëmmen Dimerase huet
Aktivitéit.Schen et al.och proposéiert datt nëmmen den Dimer vum PLA2 vum Schlangegif déi aktiv Form vum Enzym ass.D'Etude vun der raimlecher Struktur beweist och datt PLA2 vum westlechen Diamantback-Klapperschlang a Form vun Dimer existéiert.Piscivorous Verbindung
Et ginn zwee verschidde PLA ^ Ei an E2 vu Schlaangengif, an deem 仏 existéiert a Form vun Dimer, den Dimer ass aktiv, a säi dissoziéierte Monomer ass inaktiv.Lu Yinghua et al.(1980) studéiert weider d'physikalesch a chemesch Eegeschaften an d'Reaktiounskinetik vum E. Jayanthi et al.(1989) isoléiert eng Basis PLA2 (VRVPL-V) aus dem Viper Gëft.D'molekulare Gewiicht vum Monomer PLA2 ass 10000, wat fatal, antikoagulant an Ödem Effekter huet.D'Enzym kann Polymere mat verschiddene Molekulargewiichter ënner der Bedingung vum PH 4.8 polymeriséieren, an de Grad vun der Polymeriséierung a Molekularegewiicht vu Polymere erhéicht mat der Erhéijung vun der Temperatur.D'molekulare Gewiicht vum Polymer generéiert bei 96 ° C ass 53 100, an d'PLA2 Aktivitéit vun dësem Polymer erhéicht ëm zwee
Post Zäit: Nov-18-2022